Chcę zacząć od przypomnienia, które często gubi się w publicznych dyskusjach: Szczepionki mRNA przeciwko Covid to naprawdę nowatorskie produkty medyczne.
Przed wydaniem zezwoleń na dopuszczenie do obrotu w nagłych wypadkach w 2020 roku technologia szczepionek mRNA nigdy nie była stosowana na szeroką skalę u ludzi. Tylko dwa badania kliniczne, jedno przeprowadzone przez Pfizer-BioNTech i jedno przez Modernę, przetestowały tę platformę na ludziach. Łącznie w historii medycyny około 37 000 osób otrzymało szczepionkę mRNA (nie licząc wcześniejszych doświadczeń ze szczepionkami przeciwko wściekliźnie, CMV i nowotworom, ograniczonych do znacznie mniejszych badań we wczesnej fazie). Nie jest to krytyka, a jedynie stwierdzenie faktu. Oznacza to jednak, że profil długoterminowego bezpieczeństwa tych produktów był i nadal jest nie w pełni poznany.
To, co następuje, jest znane niemal wszystkim biologom molekularnym. Jest to skomplikowane, ale staram się to uprościć, biorąc pod uwagę stawkę. Ważne jest, aby jasno przedstawić ramy molekularne dla wszystkich, ponieważ sposób wytwarzania tych szczepionek bezpośrednio determinuje zawartość fiolki.. A zawartość fiolki po wstrzyknięciu rozprzestrzeni się po całym organizmie i uruchomi kaskadę zdarzeń, które mogą mieć długotrwałe konsekwencje dla zdrowia.
Transkrypcja in vitro to nie tylko szczegół produkcyjny
Modyfikowane szczepionki mRNA są produkowane w procesie zwanym transkrypcją in vitro (IVT)IVT to metoda syntezy zmodyfikowanego mRNA, który ostatecznie staje się substancją czynną szczepionki.
Nie jest to błahy szczegół techniczny. IVT zasadniczo kształtuje skład molekularny produktu końcowego.
Naukowcy z BioNTech, w tym ci bezpośrednio zaangażowani w opracowanie szczepionki Pfizera, opublikowali szczegółową recenzję1 Opisują one, w jaki sposób reakcje IVT generują nie tylko zamierzony, pełnowymiarowy mRNA, ale także szereg produktów ubocznych i zanieczyszczeń, jak są one zazwyczaj usuwane i jakie mogą być ich biologiczne konsekwencje, jeśli się utrzymają. Te instrukcje dotyczące wytwarzania wraz z wytwarzanymi produktami ubocznymi zostały również szczegółowo opisane przez Modernę w jej patentach (US10,653,712 B2 i US10,077,439 B2). Co ważniejsze, ta biologia molekularna była dobrze ugruntowana na długo przed pandemią COVID-19. Nic z tego nie jest spekulacją.
Materiał wyjściowy: matryce DNA
W istocie reakcja IVT rozpoczyna się od dwuniciowego DNA, które koduje pożądane białko. W tym przypadku białko kolca SARS-CoV-2.
Sekwencja kodująca kolce stosowana w szczepionkach mRNA to genetycznie zmodyfikowanych w celu poprawy stabilności i tolerancji komórkowej, w tym dwóch substytucji aminokwasów, które odróżniają go od kolca wirusowego. Ta modyfikacja jest zamierzony.
Sam szablon DNA może przybierać różne formy. Podczas wczesnych badań klinicznych firmy Pfizer wykorzystywano fragmenty DNA generowane metodą PCR. Jednak komercyjny proces produkcji opierał się na DNA pochodzącym z plazmidów. Ma to znaczenie, ponieważ plazmidy zawierają dodatkowe sekwencje regulatorowe. W przypadku firmy Pfizer obejmują one takie elementy, jak sekwencje promotora i ori SV40, które budzą obawy, gdyby mogły przedostać się do komórek ludzkich.
Po dodaniu tego szablonu DNA do reakcji IVT, wraz z polimerazą RNA i innymi składnikami, następuje jego transkrybowanie do mRNA (ryc. 1).
Chociaż pożądanym produktem IVT jest pełnowymiarowy produkt mRNA, rzeczywisty produkt jest bardziej złożony. Należą do niego różne produkty uboczne w postaci (1) różnych rodzajów RNA, w tym dwuniciowego RNA (dsRNA), (2) DNA przyłączonego do RNA (hybrydy RNA–DNA) oraz (3) wolnego DNA z oryginalnego matrycy (rysunek 2).
Powstawanie tych produktów ubocznych jest dobrze udokumentowane i nieuniknione, dlatego też dalsze oczyszczanie ma absolutnie kluczowe znaczenie dla bezpieczeństwa.
Oczyszczanie ma znane ograniczenia
Po wyprodukowaniu konieczne są dwa etapy oczyszczania, aby najpierw usunąć DNA, a następnie produkty uboczne RNA (rysunek 3):
Aby usunąć DNA, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się enzym o nazwie DNaza I, powszechnie stosowany do degradacji zanieczyszczonego DNA. Chociaż DNaza I jest skuteczna przeciwko wolnemu DNA matrycowemu, liczne badania, w tym prace samych naukowców BioNTech, pokazują, że DNaza I jest nieskuteczna w usuwaniu DNA przyłączonego do RNA (hybrydy RNA–DNA).
To ograniczenie nie budzi kontrowersji. Jest udokumentowane w literaturze.
Co wykazały niezależne analizy
Kontekst ten jest kluczowy dla interpretacji ostatnich niezależnych analiz gotowych fiolek ze szczepionkami.
Badacze3 i regulatory4 Zgłosili wykrycie zanieczyszczeń DNA w praktycznie każdej testowanej fiolce. Zanieczyszczenia te obejmowały zarówno dwuniciowe DNA, jak i hybrydy RNA–DNA, które wydawały się odporne na trawienie DNazą I.
W niektórych próbkach DNA kodujące kolce było obecne w ilościach ponad 100-krotnie wyższych niż w przypadku innych sekwencji plazmidowych5, co sugeruje nierównomierne lub niepełne trawienie. Sekwencjonowanie i ilościowa analiza PCR wykryły fragmenty DNA o średniej długości ~200 par zasad, a niektóre przekraczały 4 kilozasady. W kilku przypadkach zaobserwowano sekwencje obejmujące niemal cały plazmid.
Łącznie wyniki te podnoszą poważne wątpliwości dotyczące spójności i kompletności oczyszczania podczas produkcji na dużą skalę, a także potencjalnych biologicznych skutków obecności resztkowych kwasów nukleinowych u ludzi.
Dlaczego zanieczyszczenia kwasami nukleinowymi mają znaczenie biologiczne
RNA i DNA są silnymi aktywatorami wrodzonych szlaków odpornościowych. Nie jest to spekulacja. Receptory rozpoznające wzorce i szlak cGAS-STING silnie reagują na obce kwasy nukleinowe, wywołując stan zapalny, zahamowanie wzrostu, a nawet śmierć komórek.
Właśnie dlatego produkty terapii genowej podlegają ścisłemu nadzorowi bezpieczeństwa.
Jak na ironię, szczepionki mRNA przeciwko COVID-19 zostały opracowane z uwzględnieniem modyfikacji mających na celu ograniczenie tej silnej, wrodzonej aktywacji odpornościowej. Jednak hybrydy RNA-DNA i fragmenty DNA nadal będą wywoływać silną odpowiedź immunologiczną pomimo tych modyfikacji.
Wytrwałość rodzi nowe pytania
Obecnie istnieją liczne dowody wskazujące na to, że mRNA i białko kolczaste utrzymują się w tkankach ludzkich przez tygodnie, miesiące, a nawet lata po szczepieniu (Tabela 1).
Nie wiemy jeszcze, czy ta trwałość odzwierciedla przedłużoną stabilność mRNA, ciągłą translację, czy mechanizmy oparte na DNA. Biorąc jednak pod uwagę prawdopodobieństwo integracji DNA i długowiecznego, niezintegrowanego DNA plazmidowego w komórkach mięśniowych,6 nie jest nierozsądne założyć, że utrzymywanie się mRNA, białka i przeciwciał przeciwko szczepionce Spike przez wiele lat po szczepieniu nie jest niezależne od zanieczyszczeń DNA i produktów ubocznych po podaniu dożylnym.
Krótkoterminowe i długoterminowe konsekwencje dla bezpieczeństwa
Łącznie dane te nasuwają kilka ważnych pytań dotyczących bezpieczeństwa.
Po pierwsze, ostre reakcje immunologiczne, w tym burze cytokinowe i anafilaksja, zgłaszano bezpośrednio po szczepieniu. Tak silnych reakcji zapalnych nie należy od razu odrzucać jako niezwiązanych z zanieczyszczeniami, zwłaszcza biorąc pod uwagę wiedzę na temat aktywacji immunologicznej indukowanej kwasami nukleinowymi.
Po drugie, co ważniejsze, istnieją zagrożenia długoterminowe. Utrzymująca się ekspresja szczytowa może prawdopodobnie przyczyniać się do przewlekłych zespołów immunologicznych. Jeszcze bardziej niepokojąca jest możliwość integracji DNA, która niesie ze sobą ryzyko mutagenezy insercyjnej lub zaburzeń genetycznych. Oznacza to ryzyko raka lub wad rozwojowych, w zależności od miejsca i wieku integracji DNA.
Co znamienne, sama FDA w swoich ulotkach informacyjnych stwierdza, że szczepionki te nie zostały zostały ocenione pod kątem rakotwórczości (powstawania nowotworów) lub genotoksyczności (uszkadzania DNA), co jest kwestią rutynową i oczekiwaną w przypadku nadzoru nad terapią genową, gdzie standardem jest długoterminowe monitorowanie.
Luka regulacyjna wokół DNA w szczepionkach mRNA
Skoro nie ma już wątpliwości co do obecności resztkowego DNA w szczepionkach mRNA, pojawia się pytanie, czy obecne wytyczne i limity bezpieczeństwa są odpowiednie dla szczepionek mRNA. Zapewniono nas, że produkty uboczne DNA mieszczą się w granicach określonych w wytycznych regulacyjnych. Jakie są zatem wytyczne FDA dotyczące produktów ubocznych DNA i zanieczyszczeń?
Najczęściej cytowane wytyczne FDA dotyczące resztkowego DNA (≤10 ng na dawkę) zostały opracowane dla szczepionek wirusowych produkowanych w żywych komórkach, które są pofragmentowane i „nagie”, z ograniczoną zdolnością do wnikania do komórek ludzkich. Jednak szczepionki mRNA nie są produkowane w komórkach, ich resztkowe DNA nie pochodzi z komórek gospodarza, a co najważniejsze, DNA w szczepionkach mRNA nie jest nagie. Jest ono związane z systemami dostarczania LNP, które w szczególności ułatwiają DNA wnikanie do komórek. Wytyczne FDA z 2010 roku jasno wskazują, że nie ustanawiają one odpowiedniego progu bezpieczeństwa dla DNA związanego z produktami opartymi na LNP.
Inne często cytowane wytyczne pochodzą od WHO dotyczące terapii białkowych rekombinowanych, które dotyczą resztkowego DNA w produktach takich jak przeciwciała monoklonalne lub hormony wytwarzane w komórkach modyfikowanych genetycznie. Również w tym przypadku resztkowe DNA pochodzi z komórek gospodarza lub plazmidów ekspresyjnych, występuje w postaci śladowej, nieotoczonego DNA (nagiego), a produktem końcowym jest oczyszczone białko, a nie terapia oparta na kwasie nukleinowym (szczepionka mRNA). Zatem te wytyczne nie mają zastosowania do szczepionek mRNA.
Ani FDA, ani WHO nie powoływały się najczęściej na normy regulacyjne dotyczące resztkowego DNA. opracowane dla szczepionek mRNA i nie odnoszą się bezpośrednio do kwestii bezpieczeństwa.
Co WHO powiedziała o szczepionkach mRNA — po ich wdrożeniu
W 2022 r. Światowa Organizacja Zdrowia wydała wytyczne dotyczące w szczególności szczepionek mRNA7. Warto zauważyć, że dokument ten został opublikowany po globalnego wprowadzenia tych produktów. W dokumencie wyraźnie stwierdzono, że wytyczne te stanowią odpowiedź na: „kwestie bezpieczeństwa, produkcji i regulacji związane z tą nową technologią.W dokumencie zawarto również kilka ważnych stwierdzeń:
"Ponieważ nie są jeszcze dostępne szczegółowe informacje na temat metod stosowanych w produkcji, kontrole bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek mRNA nie są jeszcze standaryzowane, a niektóre szczegóły pozostają zastrzeżone i nie są publicznie dostępne, w chwili obecnej nie jest możliwe opracowanie szczegółowych międzynarodowych wytycznych lub zaleceń."
W dalszej części stwierdza się: „Szczegółowe procedury produkcji i kontroli… powinny zostać omówione i zatwierdzone przez NRA [krajowy organ regulacyjny]] na podstawie indywidualnych ustaleń."
WHO przyznaje, że kontrole szczepionek mRNA nie zostały jeszcze ujednolicone i że nie jest możliwe ustanowienie konkretnych międzynarodowych wytycznych lub zaleceń. Ponadto, nadzór regulacyjny jest wymagany w celu indywidualnej oceny każdego przypadku przez organy krajowe.
Stwierdzono to po wprowadzeniu szczepionek mRNA.
W momencie pisania tego Substacka Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) nie ustaliła jeszcze standardowych wytycznych dotyczących szczepionek mRNA ani nie przedstawiła żadnych dowodów ani danych dotyczących bezpieczeństwa, które potwierdzałyby jakiekolwiek ograniczenia dotyczące DNA w szczepionkach mRNA.
Na koniec warto powtórzyć: chociaż technologia mRNA nie jest nowa, przed pandemią COVID-19 była regulowana jako terapia genowa, a nie jako tradycyjna szczepionka. Kwestie bezpieczeństwa związane z produktami ubocznymi DNA w szczepionkach przeciw COVID-19 będą takie same jak w przypadku każdej szczepionki mRNA, w tym szczepionek na grypę, RSV, a nawet szczepionek mRNA na raka.
Dzieje się tak, ponieważ produkty mRNA różnią się zasadniczo. Muszą one wniknąć do komórek i poinstruować je, aby wytworzyły obce białko. To rozwiązanie różni się od innych konwencjonalnych szczepionek, które dostarczają białko bezpośrednio. Nie ma precedensu klinicznego dla tej platformy ani dla wielokrotnego dawkowania. I z pewnością nie ma precedensu w skali populacyjnej.
Na tym etapie, gdy nie ma pandemii, a gromadzą się dane mechanistyczne i obserwacje kliniczne, a na rynku pojawia się coraz więcej produktów szczepionkowych mRNA, potrzebujemy przejrzystości i bezpośredniego zaangażowania w poważne badania bezpieczeństwa prowadzone przez organy regulacyjne, w szczególności przez FDA, która ustala kluczowe wytyczne dotyczące produkcji tych produktów – zwłaszcza w odniesieniu do produktów ubocznych DNA.
Nowa technologia wymaga nowego rodzaju kontroli – nie milczenia, gaslightingu ani cenzury.
Referencje
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S i in. Mol Pharm. 4 kwietnia 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang i wsp. (2004) – „Wykrywanie integracji DNA plazmidowego z genomowym DNA gospodarza po wstrzyknięciu domięśniowym i elektroporacji” (Gene Therapy, 2004). U myszy wstrzyknięto domięśniowo nagie DNA plazmidowe, a następnie poddano je elektroporacji w celu zwiększenia wychwytu. Stosując wysoce czułą reakcję PCR na oczyszczonym genomowym DNA (z separacją żelową w celu usunięcia form pozachromosomowych), autorzy zidentyfikowali cztery niezależne zdarzenia integracji 4 tygodnie po wstrzyknięciu. Sekwencjonowanie połączeń potwierdziło losowe miejsca integracji (brak preferencyjnych hotspotów), co jest zgodne z łączeniem niehomologicznych końców. Częstość integracji była niska, ale mierzalna. Jest to jeden z najwyraźniejszych dowodów na rzeczywiste spontaniczne zdarzenia integracji in vivo nagiego DNA plazmidowego w mięśniach. Warto zauważyć, że w badaniu wykorzystano wzmocnione dostarczanie DNA poprzez elektroporację, które można porównać ze wzmocnionym dostarczaniem za pomocą LNP.
Martin i wsp. (1999) – „Szczepionka przeciw malarii z DNA plazmidowym: potencjał integracji genomowej po wstrzyknięciu domięśniowym” (terapia genowa u ludzi). W tym wcześniejszym badaniu testowano plazmidowe DNA IM u myszy i wykorzystano hybrydyzację Southern blot i PCR na genomowym DNA o dużej masie cząsteczkowej do badania integracji. Chociaż trwałość była głównie pozachromosomowa, autorzy zgłosili dowody sugerujące rzadką integrację w niektórych próbkach (choć nie tak jednoznacznie zsekwencjonowanych jak późniejsze prace). Ustanowiło to punkt odniesienia dla niskiego ryzyka, ale potwierdziło potencjał zdarzeń o bardzo niskiej częstotliwości, co wpłynęło na późniejsze wytyczne FDA dotyczące szczepionek DNA.
Ledwith i wsp. (2000) – „Szczepionki DNA plazmidowe: Badanie integracji z DNA komórkowym gospodarza po domięśniowym wstrzyknięciu myszom” (Intervirology). Nagie DNA plazmidowe wstrzyknięte domięśniowo myszom wykazało, choć nie zaobserwowano żadnej wykrywalnej integracji, DNA było nadal wykrywane w mięśniu czworogłowym uda do 26. tygodnia. DNA było pozachromosomowe.
7 Komitet Ekspertów WHO ds. Standaryzacji Biologicznej, 74. Raport, Załącznik 3. Ocena jakości, bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek z mRNA w zapobieganiu chorobom zakaźnym: względy regulacyjne https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
Dołącz do rozmowy:
Opublikowane pod a Creative Commons Uznanie autorstwa 4.0 Licencja międzynarodowa
W przypadku przedruków ustaw link kanoniczny z powrotem na oryginał Instytut Brownstone Artykuł i autor.
